血***蛋白的离心分离技术

       血***蛋白是由血液中脂质与某些特异的蛋白质组成的一类不均一的复合物因其所含脂与载脂蛋白的比便不同，其密度范围在0.96g/ml或更低至1.21g/ml之间。纸电泳中显示四条带，即：乳摩微粒、极低密度脂蛋白（VLDL），也称前β脂蛋白）、低密度脂蛋白（LDL，也称β脂蛋白）、高密度脂蛋白（HDL，也称 脂蛋白）。每种脂蛋白还可以再细分为更多的亚组分。
　　用电泳法分离含载蛋白较高的组份（HDL，VHDL）比较成功，而离心离法则适用于各种密度的血***蛋白分离。

一、 梯度材料
　　血***蛋白密度较低，常用的梯度本材料为N***,NaI,KBr,KI等，常用缓冲剂为ED
表一 常用梯度材料的配置及密度（20oC）

二、 予分离：
1、 血细胞与***分离：
·离心参数：全血，角转头，3000rpm×20min
·结果：沉淀为血细胞， 上部为***。
2、 乳糜粒分离：禁食12小时以上人血浆中乳糜料含量***，已进食者因其血浆含乳糜量高，应先离心除乳糜粒。
·离心机参数：4×106（g xmin）,10oC，各种转头及转速均可。
·梯度液配置：离心管下部3/4容积加血浆，上部1/4窖加0.15Mn***+0.3MEDTA，ph7.4
·结果：乳糜粒上浮，吸出。
3、 ***蛋白分离：除去球蛋白，白蛋白及其他蛋白质。
·离心参数：（2.5-3）×106（g xhr），各种转达头均可，如角转头70,000rpm x6hrs,100C
·配置：管容量1/3为***，2/3为1.31g/ml,N***+NaBr,搅拌后终密度为1.21g/ml
·结果：管上部1/6容积为血***蛋白，下部5/6为其他蛋白。

三、 方法：
1、 顺序浮选法：
　　a：***法：***早使用的方法，40000rpm×24hrs×3次，10oC N***+NaBr 梯度按1.006，1.063，1.21顺序浮选，每次在管上部取出不同密度之脂蛋白。操作简单，分辨率高、得率高、费时、成本高。
　　b：超高速法：100000rpm×2.5hrs×2次，10oC，100000rpm×4hrs×1次N***+KBr+EDTA梯度按不含密度选出VLDL，LDL，HDL（文献给）
2、 单次离心法：
a：单次甩平分离（文献4）
·用***高转速为25000~28000rpm，6×40ml甩平转头以1.006g/ml N***液及1.35g/ml（N***+NaBr+EDTA）液配成从1.006至1.21的8层不边疆阶梯度，***下部用***与KBR配成1.25g/ml样品液，25000rpum×4hrs,4oC一次得到VLDL，LDL，HDL不同层区带。
·用***高转速为40000 rpm，6×13ml甩平转头，40000rpm×24hrs，200C，不续KBr梯度1.006-1.21g/ml，细长管，分层清晰。回收率高，离心时间长（文献2）
b：单次垂直管分离：（文献1）
·N***/Kbr或N***不连续梯度单管容量从5ml到40ml，转速从50000rpm~80000rpm，离心（0.5-3）hrs，下层用Kbr（或NaBr）将***调至1.3g/ml上层用1.006g/ml,N***液，10oC-20oC,慢加、减速一次分出。
·N***/Sucrose 不连续梯度下层为48%w/w Sucrose，中层***在4Mn***中，上层为0.67M N***+0.05%EDTA,离心能数同上，时间较长。
c：区带转头大容量分离：（文献2）
·离心参数：区带转头，***高转速30000-48000rpm，容量从650ml-1900ml，每次可分离***50-150ml，低速加样及卸载，分离转速，大转头（25000-28000rpm）×1hr 10oC-20oC
·梯度液：N***+NABR或KBR+EDTA，不连续或线性梯度，样品在***大密度层，近转头核心处用纯水作隔离层，分离室***外部用高密度N***/KBr或N***/NaBr作缓冲层
·收集：泵出后依次经带流动地的紫外检测仪检测，自动部份收集器收集。

四、 讨论
　　1、 用以上方法分离的VLDL，LDL，MDL，还可以进一部用长离心管缩小不连续梯度密度差，分离出其亚组份。
　　2、 实验质量很大程度上取于密度标定，配置后可用密度计或折射仪校核。
　　3、 用分析超离心法可以***分离微量血***蛋白，并可测定各种组份（包括其亚组份）的上浮系数Sf